Studi Performa Katalitik Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a

Studi Performa Katalitik Siklodekstrin Glukosiltransferase Wild Type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F dari Bacillus sp. A2-5a

1,2Tina Rostinawati, 1Catur Riani, 1Elfahmi, 1Yeyet Cahyati Sumirtapura and 1Debbie Sofie Retnoningrum

1Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Pharmacy, Bandung Institute of Technology, Ganesha 10, Bandung, Jawa Barat, 40132, Indonesia

2Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, Padjadjaran University, Bandung, Sumedang Km 21, Jatinangor, Jawa Barat, 45363, Indonesia

Siklodekstrin (CD) merupakan oligosakarida yang terdiri atas enam sampai delapan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan 1,4 glikosida (CD-α, -β dan -γ). Molekul ini memiliki kemampuan membentuk kompleks inklusi dengan suatu molekul ”tamu” (guest) yang bersifat hidrofobik. CD membentuk cincin yang rongganya bersifat hidrofob namun permukaan luarnya bersifat hidrofil sehingga memungkinkan molekul tamu yang tidak larut air untuk berkompleks di dalam rongganya. Senyawa ini diaplikasikan secara luas pada berbagai industri farmasi, bioteknologi, makanan, kimia, tekstil, pertanian dan juga untuk perlindungan lingkungan. CD dihasilkan melalui reaksi enzimatis siklodekstrin glikosiltransferase (CGTase) terhadap pati sebagai substrat. CGTase yang berasal dari Bacillus sp. A2-5a (BA2-5a) merupakan CGTase-β yang menghasilkan CD-β sebagai produk utamanya dengan sebagian kecil CD-α dan selebihnya CD-γ. Urutan sekuen asam amino CGTase BA2-5a memiliki identitas 80-99% dengan CGTase yang memiliki produk CD dengan komposisi CD-α/-β/-γ yang hampir sama dengan BA2-5a CGTase bahkan pada beberapa CGTase tidak terbentuk CD-α. CGTase BA2-5a dan CGTase-CGTase tersebut memiliki residu His pada posisi 47 dan residu Pro pada posisi 89 (43 dan 84 pada CGTase BA2-5a). Untuk mengkaji peran residu His dan Pro dilakukan substitusi asam amino pada BA2-5a CGTase yaitu H43K dan P84Y. Pada penelitian sebelumnya panjang/pendeknya ukuran residu pada posisi 47 ini akan berdampak pada spesifisitas produk.Pada semua CGTase yang diketahui urutan sekuen asam aminonya, residu Tyr pada posisi 100 (93 untuk CGTase BA2-5a) merupakan residu yang sangat lestari untuk CGTase. Substitusi Y100F pada CGTase Bacillus sp. I-5 berdampak pada spesifisitas produk dengan meningkatkan rasio CD-β. Demikian halnya dengan residu Tyr pada posisi 195 (188 pada CGTase BA2-5a) pada hampir semua CGTase, kecuali CGTase yang berasal dari bakteri termofilik merupakan residu yang lestari. Tujuan penelitian ini untuk mengkaji peran residu His43, Pro84, Y93 dan Y188 pada CGTase BA2-5a terhadap performa katalitik enzim dan spesifisitas produk. Untuk mendapatkan CGTase mutan (H43K), (P84Y), (Y93F) dan (Y188L) dilakukan mutagenesis terarah pada kerangka baca terbuka cgtase pada kodon 43, 84, 93, dan 188. Penelitian ini juga bertujuan untuk mengkaji peran residu pada CGTase BA2-5a yang belum pernah dilaporkan sebelumnya. Untuk mendapatkan CGTase mutan ini dilakukan mutasi secara acak dengan PCR pada kerangka baca terbuka cgtase. Dengan metode ini didapatkan CGTase mutan S468F. Keenam protein CGTase (wild type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F) berhasil dioverproduksi dan dipurifikasi sehingga mendapatkan protein-protein murni dengan ukuran 76,39 kDa. Terhadap CGTase (wild type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F) tersebut dilakukan uji pendahuluan zymography yang meliputi uji hidrolisis dan siklisasi. Hasil uji zymography menunjukkan CGTase (wild type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F) mempunyai aktivitas hidrolisis dan siklisasi. Untuk mengetahui pengaruh substitusi terhadap karakter enzim dilakukan penentuan pH/suhu optimum dan stabilitas suhu/pH. Semua substitusi tidak merubah suhu optimum (60°C), pH optimum (pH 7), suhu stabilitas (T50) untuk wild type, H43K, P84Y, Y93F, Y188L dan S468F : 64,2; 64,6; 65,1; 65,4; 65 dan 64,1 (°C) dan pH stabilitas pada rentang pH 6-8. Untuk mengetahui pengaruh substitusi terhadap konformasi protein dilakukan uji stabilitas termal (Tm). Hasil menunjukkan bahwa puncak emisi CGTase wild type adalah pada suhu 69°C berbeda tidak lebih dari 2°C dengan puncak emisi CGTase H43K (69°C), Y93F(69°C), P84Y(71°C), Y188L(67°C) dan S468F(68°C). Berdasarkan nilai Tm yang dihasilkan menunjukkan CGTase-CGTase mutan tidak mengalami perubahan konformasi. Untuk mengetahui pengaruh substitusi terhadap performa katalitik dilakukan uji kinetika dan produk spesifisitas. Pendekatan molecular docking dilakukan untuk menjelaskan secara detail interaksi enzim-substrat. Analisis kinetika menunjukkan CGTase BA2-5a merupakan enzim non-kooperatif dan substitusi tunggal kecuali H43K dan Y93F, merubah sifat non-kooperatif menjadi negatif kooperatif. Substitusi H43K menurunkan K0,5 dan kcat yang menunjukkan mutan ini memiliki afinitas yang lebih baik terhadap substrat tetapi dengan performa yang menurun dalam pembentukan produk. Sebaliknya, substitusi S468F meningkatkan K0,5 yang menunjukkan Ser468 berperan dalam pengikatan substrat. Nilai kcat turun secara signifikan tiga sampai sepuluh kalinya pada substitusi Y93F dan Y188L. Hasil penelitian sebelumnya juga menunjukkan hal yang sama, bahkan residu Tyr188 CGTase BA2-5a juga merupakan residu yang penting untuk aktivitas siklisasi. Rasio CD-α meningkat 50 % pada substitusi H43K dan P84Y dan menurun dengan persentase yang sama pada substitusi S468F. Rasio CD-γ meningkat 14 dan 23% pada substitusi H43K dan Y188L dan menurun 9,5 % pada substitusi P84Y. Substitusi S468F tidak mempengaruhi perubahan rasio CD-β dan –γ dan menurunkan rasio CD-α. Substitusi Y93F meningkatkan rasio CD-β sebesar 6 %, menurunkan CD-γ 14% dan tidak membentuk CD-α. Hasil ini mendukung penelitian sebelumnya dan untuk pertama kalinya CD-α tidak terbentuk akibat dari substitusi Y93F. Substitusi P84Y tidak mempengaruhi parameter kinetik CGTase BA2-5a. Hasil penelitian ini menunjukkan untuk pertamakalinya CGTase BA2-5a merupakan enzim non-kooperatif; residu Pro84, Tyr188 dan Ser468 dibutuhkan untuk mempertahankan sifat non-kooperatif; fakta baru untuk Ser468 yang berada di domain C bertanggung jawab untuk pengikatan substrat dan substitusi Y93F tidak menghasilkan produk CD-α. Kata kunci: BA2-5a, CGTase, substitusi, performa katalitik, non-kooperatif, spesifisitas produk, Ser468. Artikel lengkap dapat diunduh dalam link berikut: http://scialert.net/qredirect.php?doi=biotech.0000.71763.71763&linkid=pdf

Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21, Jatinangor 45363 - Indonesia Telepon: (022) 7796200 Faksimile: (022) 7796200
Contact Us: farmasi@unpad.ac.id